Da die Artistenbibliothek in ihren Beständen stark beschnitten und zudem den Jesuiten zugänglicher war als den weltlichen Professoren (die Jesuiten wohnten im sogenannten Collegium vetus, dem Gebäude, das auch die Bibliothek beheimatete), beschloß der Vizekanzler der Universität, Martin Eisengrein, die Neugründung einer Universitätsbibliothek. Dabei trat er an Gelehrte seiner Zeit heran, damit sie ihre Büchersammlungen der Bibliothek vermachten. Die Eisengreinsche Gründung avancierte in kurzer Zeit zu einer humanistischen Universalbibliothek.

Den Grundstock dieser neuen Bibliothek bildeten die 6.062 Bände des Augsburger Bischofs Johann Egolph von Knöringen, die nach der feierlichen Protokollierung seiner Stiftung 1573 in die Bibliothek gelangten. Die Stiftung umfasste auch einen jährlich vom Würzburger Bischof zu zahlenden Betrag von 100 Gulden für die Bestandsvermehrung und die Besoldung eines Bibliothekars.

Weitere wichtige Schenkungen waren die Bibliotheken des bayerischen Kanzlers Simon Thaddäus Eck, einschließlich der Büchersammlung seines Stiefbruders, des Gegenreformators Johannes Eck, die des Juristen und Theologen Rudolf Clenck und Eisengreins eigene Bibliothek. 1578 belief sich die Gesamtzahl der Bände auf rund 15.000, wobei gut zwei Drittel aus Schenkungen stammten.

Als Bibliotheksgebäude nutzte man ein von Knöringen erbautes einstöckiges Haus in der heutigen Jesuitenstraße, das jedoch 1587 wieder abgerissen wurde (heute befindet sich dort die Heilig-Kreuz-Kirche). Die Bibliothek zog in das mittlerweile von den Jesuiten geräumte Collegium vetus um und wurde um 1589 mit den Beständen der Artistenfakultät vereint.

Der Dreißigjährige Krieg verschonte die Bibliothek weitestgehend, da Gustav Adolf von Schweden Ingolstadt 1632 vergeblich belagern ließ. Wegen des Krieges blieben jedoch die Stiftungsgelder aus, so daß Kauferwerbung sowie fachliche Betreuung der Bibliothek brachlagen. 1621 erhielt die Bibliothek über den Nachlass des Juristen, herzoglichen Sekretärs und Archivars Christoph Gewold einen ihrer bedeutendsten Schätze, die älteste erhaltene Handschrift der Lex Baiuvariorum (entstanden um 800).

1720 erfolgte die Gründung einer eigenständigen medizinischen Fakultätsbibliothek, und Johann Vitus Kiniger legte 1723/24 ein neuen Bandkatalog für die Universitätsbibliothek an, der auf 40 Jahre hin das zentrale Arbeitsinstrument für den Bestandsnachweis blieb. 1749 tauchte erstmalig die Bezeichnung "Universitätsbibliothekar" auf, 1752 die "Universitätsbibliothek".

Anläßlich der bis dahin alljährlich stattfindenden Knöringen-Gedenkfeier hielt der Student Adam Weishaupt Anfang März 1768 die letzte Lobrede auf den Stifter. 17 Jahre später, 1785, wurde Weishaupt, mittlerweile Professor für kanonisches Recht und heimlicher Begründer des Illuminaten-Ordens (1776), aus seinem Amt entlassen, vordergründig weil er als übereifriger Aufklärer wiederholt auf die Anschaffung von Pierre Bayles "Dictionnaire historique et critique" und die Werke Richard Simons für die Universitätsbibliothek gedrungen hatte.  [weiter]